推荐用6％丙烯酰胺、非梯度胶为起点。可使用两种胶：一种在相对短的时间获得较短的寡核苷酸信息；另一种是用较长时间以使较长的寡核苷酸得到最大限度的分离。这两种凝胶分离过程，采用6％丙烯酰胺，可以从一套测序反应中获得300~350个碱基的序列信息。另一种可选的方案是使用两种不同浓度的胶，使较短片段和较长片段的寡核苷酸得到最大限度的分离。
材料
盛于喷射洗瓶的异丙醇或70%(V/V)乙醇
5%(V/V)二甲基二氯硅烧的氯仿溶液
变性丙烯酰胺溶液
TEMED
10%(m/V)过硫酸铵(APS，每周新配一次，储于4℃）
1XTBE电泳缓冲液，~8.9
溶于甲酰胺／染料溶液中的测序样品
5％乙酸／5％甲醇(V/V)固定液（可选）
30cmX40cm测序胶前后玻璃平板
0.2~0.4mm厚度均一的垫片
大的图书装订夹
60ml注射器
0.2~0.4mm鲨鱼齿或常规样品梳子
测序凝胶电泳装置和电源
巴斯德吸管或Beral细管
34的铝盘（可选）
测序加样移液器吸头
浅的固定托盘（可选）
46cmX57cm3MM转印纸
干胶机，预热到80℃
X射线盒和KodakXAR-5X射线胶片
步骤
首先要用肥皂及水小心严格地清洗一对30cmX40cm玻璃平板，用去离子水彻底冲洗后晾干。用喷射洗瓶喷异丙醇或70％乙醇使平板湿润，然后用Kimwipe纸或其他无绒纸巾将平板擦干。
戴手套在通风橱中工作，用浸湿了含5％二甲基二氯硅烷的氯仿溶液的Kimwipe纸在每片平板的其中一面加一层此溶液，并小心擦拭整面平板。待硅化层干后，用Kimwipe纸以70％乙醇或异丙醇擦净并干燥，最后再检查平板有没有灰尘或其他颗粒。
按厂商指南用0.2~0.4mm均厚的垫片和大的书本装订夹子组装凝胶胶板，注意垫片与平板的边、底压紧对齐。
制作每块凝胶时，在100ml烧杯中配制60ml变性丙烯酰胺凝胶溶液。在灌胶前，彻底混匀60μITEMED和0.6ml10％过硫酸铵于丙烯酰胺溶液中，以起始聚合反应。
将丙烯酰胺溶液注入60ml注射器，避免产生气泡。让短平板朝上，并使凝胶平板夹层与桌面成45°角，沿着平板的一边慢慢将丙烯酰胺溶液推入两片平板之间。除去气泡，可以敲打或摇动平板，直至气泡浮到胶液上面。
观察聚合反应。如果有胶漏出，用书本装订夹夹紧漏胶部位，以减缓漏胶或使漏胶停止。
聚合反应的时间（通常为10min~2h)依赖于温度和TEMED及APS的用量。聚合反应完成时，在梳子和凝胶表面交界处可以观察到界面。
除去底部垫片，用水清洗平板表面溢出的尿素和丙烯酰胺溶液，用刀片除去样品梳周围的过量聚丙烯酰胺凝胶，然后轻轻拔出梳齿，避免挤压或拉伤凝胶（或加样孔）。用水清洗梳齿，准备好在步骤11使用。
凝胶电泳装置的下层储液槽加入1XTBE缓冲液，使凝胶夹层能浸泡在2~3cm的一层缓冲液中，将凝胶夹层放在装置上。先让凝胶夹层的一角进入缓冲液，这样随着另一角的下垂凝胶夹层底部边缘的气泡就会被赶出来。根据制造商的说明书，将玻璃板固定在装置上。
将清洗干净的鲨鱼齿样品梳重新插回凝胶夹层，使齿尖刚刚插入凝胶，用巴斯德吸管或Beral细管以1XTBE缓冲液彻底清洗加样孔，以除去零星的聚丙烯酰胺碎片。
加样前，在45V/cm凝胶的电压降下预电泳，使凝胶预热，即在1700V、70W恒定功率下电泳约30min（或根据制造商的说明书）。
为了保证在电泳过程中传热均匀，可以将一块铝板贴在前面玻璃板上用书夹夹紧。铝板一定不能接触到下槽的缓冲液中。
在甲酰胺／染料溶液中加入测序样品，95°C加热2min,然后置于冰上。在加样前，清洗加样孔除去浸进孔中的尿素。用测序加样吸头加样（每次加样后冲洗2次），每孔加样2~3μI。为了看到每个样品的轨迹，在玻璃板外侧为每个泳道或每系列4个反应／泳道做好标记。
根据制造商的推荐，在45~70W恒定功率下电泳，凝胶温度保持在约65°C。监视标记染料的迁移。
电泳完毕时，排出上下液槽的缓冲液，并按放射性废物处理丢弃液体。从电泳装置中取出凝胶夹层，并在冷自来水下冲洗直至两面玻璃平板表面都冷却为止。
将夹层平放在纸巾上，凹口玻璃平板（短平板）朝上，除去多余的液体及夹子。取出一边的垫片。两片玻璃平板之间插入一个长的金属压舌板，轻轻转动压舌板将玻璃平板撬起使之分开。凝胶应贴在下面的玻璃平板，如果贴在上面的平板，则将它翻转过来。慢慢分离上面玻璃板，使之完全与凝胶分开。移去第二个垫片和周围多余的聚丙烯酰胺碎片。
如果样品含35S，直接将凝胶连同玻璃平板一起放人浅托盘中，轻轻覆盖一层约2cm的5％乙酸／5％甲醇固定液，浸泡10~15min,不时轻轻摇动托盘使凝胶与玻璃平板松开。然后，小心地使凝胶保持在玻璃板的中央，靠吸力或重力完全除去固定液，小心从托盘中将平板连同凝胶取出，放在工作平台上。尿素会猝35S的信号。从含32p的凝胶除去尿素并非必需，但可增加信号的清晰度。
将两张干的Whatman3MM转印纸，叠齐如同一张一样，慢慢地放在凝胶的上面，从凝胶的一端开始缓慢地向另一端放下，以避免气泡的产生。从平板上剥起转印纸，凝胶应和它一起被揭起，逐渐从玻璃板上卷起纸／凝胶，直至剥离。
将滤纸／凝胶放在预热(80°C）的干胶机中，上面覆盖一张保鲜膜，避免产生气泡，将胶在80°C中完全干燥(20min~1h)。从干胶上揭去保鲜膜，将干胶放在X射线曝光盒中，KodakXAR-5X射线胶片直接与凝胶接触，不用增感屏
在室温放射自显影（通常过夜）。
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