防治作物卵菌病害的新型抑制剂：癸二烯酸

疫霉属卵菌是最具破坏性的植物病原体之一，因其发病快、破坏性强、传播迅速等特点，防治难度极大，给农业生产造成严重威胁。目前，卵菌病害防治主要依赖化学杀菌剂的使用，导致农药残留和病原菌抗性等负面效益日益突出。此外，化学杀菌剂多含锡、铜或其他持久性污染物，危及生态系统和人类健康。由于在生理、代谢等方面与真菌显著不同，对真菌病害高效的杀菌剂对卵菌病害多没有防治效果，导致生产上可供选择的杀菌剂种类较少。因此，亟需开发环境友好且能克服病原菌抗药性的新型防治技术。

通过正向硅胶柱层析，对棘孢木霉HG1和枯草芽孢杆菌Tpb55共培养发酵液提取物进行分离，得到7个组分（−）。采用菌丝生长速率法验证7个组分在0.5mg/mL浓度下的抑菌活性，结果如图3-1和表3-3所示。根据核磁（图3-2和图3-3）和质谱（图3-4）分离纯化的抗烟草疫霉生物活性成分进行了鉴定（IRIEetal.,1997），确定其分子式为C10H16O2，名称为2E,4E-癸二烯酸，外观为淡黄色固体，其结构式图3-5所示。由于DDA的产率较低，因此以2E,4E-癸二烯醛为原料合成了DDA，以备进一步实验。

共培养发酵液粗分离的7个组分的抑菌活性

DDA对烟草疫霉的毒力回归方程

之前的研究已经报道，一些MCFA，包括庚烷酸、辛酸、壬酸和月桂酸，对植物病原菌具有抗真菌能力（SOLANOetal.,2020;ZHANGetal.,2015）。ZHAOetal.（2021）从1株海洋真菌中分离出3种新的具有抗真菌活性的脂肪酸衍生物。据我们所知，本研究首次报道了DDA对植物病原菌的抑制活性。我们的研究结果显示，DDA首次对卵菌表现出显著的特异性抑制活性，远远优于之前报道的其他中链脂肪酸，使DDA成为一种潜在的抗卵菌病原体的选择性药物。

通过扫描电镜及透视电镜观察可知，DDA对烟草疫霉菌丝细胞形态和超微结构具有显著影响。细胞壁受损的细胞的细胞质可用染料溶液染成深紫色，而正常细胞的细胞质为无色或浅紫色。如图4-3所示，未添加DDA组的菌丝体细胞质无色或染色浅紫色。然而，DDA处理后的细胞被严重染成深紫色，进一步证明DDA可以破坏烟草疫霉的细胞壁完整性。

癸二烯酸对烟草疫霉菌丝超微结构的影响

测定活性氧水平和抗氧化酶活性，以评价DDA对烟草疫霉氧化应激的影响。DCFH-DA广泛用于检测内源性活性氧的产生。图4-8（a）显示，DDA处理的菌丝体荧光密度显著增加，而对照组仅观察到少量荧光。H2O2是一种重要的活性氧，其在处理的菌丝体中的含量以剂量依赖的方式远高于对照（图4-8（b）），表明DDA诱导烟草中的活性氧积累。

DDA对烟草疫霉菌丝体SOD酶活的影响如图4-7所示。处理组的SOD活性始终低于对照组，并且与DDA浓度呈负相关（图4-8（c））。因此，推测DDA胁迫可抑制SOD酶活性。此外，MDA含量与SOD含量呈相反趋势，表明DDA可诱导细胞膜脂质过氧化，且脂质过氧化与DDA浓度呈正相关（4-8（d））。

癸二烯酸（EC50和2倍EC50）对烟草疫霉氧化应激的影响

采用PI染色观察细胞膜通透性的变化，在DDA处理12h的菌丝体中检测到强荧光，并且随着DDA浓度的增加而增强，而在对照组中几乎未检测到荧光（图4-9（a））。结果表明，DDA降低了菌丝活力，破坏了细胞膜的完整性。此外，通过检测上清液的相对电导率和细胞含量，验证了DDA对烟草疫霉细胞膜通透性的影响（图4-9（b））。随着DDA浓度的增加和处理时间的延长，处理组的相对电导率和细胞含量（还原糖、可溶性蛋白质和核酸）显著高于对照组（图4-9（c）、4-9（d）和4-9（e））。因此，我们推测DDA可能破坏细胞膜通透性，导致细胞内容物渗漏，导致细胞外相对电导率增加。

癸二烯酸处理（EC50和2倍EC50）对烟草疫霉细胞膜的影响

DDA处理组和对照组ATP含量的变化趋势基本相同；随着DDA浓度的增加和处理时间的延长，ATP含量逐渐降低（图4-10（a））。然而，处理组的ATP酶活性先升高后降低，这与对照组的增加趋势完全不同，可能是因为ATP酶活性先升高以应对DDA造成的胁迫，随后由于能量系统严重受损而降低（图4-10（b））。此外，DDA以浓度依赖的方式降低CA含量（图4-10（c））。以上结果表明，DDA可能通过干扰能量代谢而抑制烟草疫霉的生长。

癸二烯酸处理（EC50和2倍EC50）对烟草疫霉能量代谢的影响

上述结果证实DDA可攻击细胞膜和线粒体，破坏细胞膜完整性，导致活性氧的过度积累，进一步加剧细胞膜损伤，干扰细胞能量利用和代谢途径，导致烟草疫霉失活或死亡。总的来说，本研究表明DDA有望成为一种新的卵菌抑制剂（图4-11）。

DDA对烟草疫霉的作用模式图