基因克隆是分子生物学中的一种基本的操作方法。即载体构建，构建的实验通俗点来说就是”切、接、转、增、检”，切目的片段和载体，将正确的片段和载体连接，做转化，扩大培养增加构建好的载体数，送测序进行检测；在具体的实验中因为构建的方法不一样会有很多的细节发生变化，现下用的较多的就是双酶切和同源重组的方法。通过双酶切来构建载体是其中常用的一种方法，这种方法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理，用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4DNA连接酶作用下进行连接，从而实现基因克隆。
一、目的基因的扩增
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PCR
分类
货号
产品
常规
abs60037
2×TaqPCRMasterMix(forPAGE)
abs60036
2×TaqPCRMix
高保真PCR
abs60034
2×XeroxPCRMasterMix
abs60056
2×PfuMasterMix
abs60055
2×PfuMasterMix（QuickLoad）
abs60062
2×FastPfuMasterMix
abs60061
2×FastPfuMasterMix（QuickLoad）
热启动PCR
abs60033
2×HotStartTaqPCRMixLoadingDye-free
abs60032
2×HotStartTaqPCRMixwithLoadingDye
abs60057
2×HotStartTaqplusMasterMix（QuickLoad）
长片段PCR
abs60035
2×LongTaqPCRMasterMix
产物回收
abs60151
磁珠法PCR产物回收试剂盒
abs60098
DNA凝胶/PCR纯化试剂盒
DNA、RNA提取
RNA提取
abs60154
Trizol
abs60027
组织/细胞RNA快速提取试剂盒（DnaseI）
abs60028
植物RNA快速提取试剂盒（DNaseⅠ)
逆转录
abs601510
cDNA第一链合成预混试剂（含去基因组）
DNA提取
abs60012
组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒
abs60010
广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒
abs60011
快捷型植物基因组DNA提取试剂盒
abs60018
真菌基因组DNA快速提取试剂盒
二、目的基因和质粒载体的酶切和回收
限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，所选择的的双切酶最好是公用的buffer，一致的反应的条件。两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。包括酶的用量，以及产物或者质粒与酶之间的量的把握也是至关重要的，即避免酶切不完全的情况，也在规定的时间内达到最好的酶切效果。回收可以采用凝胶电泳跑电泳切胶来进行，也可以采用简单的柱式产物回收的方法，由于切割后不需要的片段很短，所以在柱式纯化中可以过滤掉，避免了切胶回收的复杂的操作。
分类
货号
产品
琼脂糖
abs44056210
琼脂糖
电泳缓冲液
abs9327
TBE10X
DNAMARKER
abs60002
DL2000DNAMarker
abs60003
DL2000+DNAMarker
abs60004
DL5000DNAMarker
abs60005
DL5000+DNAMarker
abs60006
DL8000DNAMarker
abs60007
DL15000DNAMarker
abs60008
50bpLadderDNAMarker
abs60009
100bpLadderDNAMarker
DNA上样缓冲液
abs9326
5xDNASampleLoadingbufferforAgarosegel
核酸预制胶
abs9314
核酸非变性预制胶5%,10wells
abs9315
核酸非变性预制胶10%,10wells
abs9316
核酸非变性预制胶15%,10wells
abs9317
核酸非变性预制胶5%,15wells
abs9318
核酸非变性预制胶10%,15wells
abs9319
核酸非变性预制胶15%,15wells
abs9320
核酸变性预制胶5%,10wells
abs9321
核酸变性预制胶10%,10wells
abs9322
核酸变性预制胶15%,10wells
abs9323
核酸变性预制胶5%,15wells
abs9324
核酸变性预制胶10%,15wells
abs9325
核酸变性预制胶15%,15wells
核酸染料
Abs9115
Goldview(EB替代品)
钙鳌合剂
abs9263
EGTA溶液(0.5mol/L,)
三、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶首先是在细菌体内发现的，几乎所有的细菌的属、种都发现了这种酶。它是可以识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。每个限制性内切酶会识别特定的DNA序列，根据不同的限制酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远处的位置切割DNA，识别序列通常是4-8bp，酶切之后会形成粘性末端（5ˊ端或3ˊ端突出）或者平末端。（图1）
根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（TypeI）、第二型（TypeII）及第三型（TypeIII）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。其中TypeII型限制性内切酶只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序列（palindromesequence），所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列；是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类，例如：EcoRI、HindⅢ、BamHI、ApaLI、。有些酶的切割位点在回文的一侧（如EcoRI、BamHI、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ类酶如AluI、BsuRI、BalI、HalⅢ、HPaI、SmaI等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端。
图1：特定的限制酶切割后产生的粘性末端和平末端
爱必信限制性内切酶以及T4连接酶产品订购信息
货号
产品
货号
产品
abs60200
快速内切酶ApaLI
abs60223
快速内切酶NcoI
abs60201
快速内切酶AscI
abs60224
快速内切酶NdeI
abs60202
快速内切酶AvrII
abs60225
快速内切酶NheI
abs60203
快速内切酶BamHI
abs60226
快速内切酶NotI
abs60204
快速内切酶BclI
abs60227
快速内切酶NruI
abs60205
快速内切酶BglII
abs60228
快速内切酶NsiI
abs60206
快速内切酶BsaI
abs60229
快速内切酶PacI
abs60207
快速内切酶BstBI
abs60230
快速内切酶PstI
abs60208
快速内切酶BstEII
abs60231
快速内切酶PvuII
abs60209
快速内切酶ClaI
abs60232
快速内切酶SacI
abs60210
快速内切酶DpnI
abs60233
快速内切酶SacII
abs60211
快速内切酶DpnII
abs60234
快速内切酶SalI
abs60212
快速内切酶EagI
abs60235
快速内切酶SbfI
abs60213
快速内切酶EcoRI
abs60236
快速内切酶SmaI
abs60214
快速内切酶EcoRV
abs60237
快速内切酶SpeI
abs60215
快速内切Esp3I(BsmBI)
abs60238
快速内切酶SphI
abs60216
快速内切酶FspI
abs60239
快速内切酶SspI
abs60217
快速内切酶HindIII
abs60240
快速内切酶StuI
abs60218
快速内切酶HinfI
abs60241
快速内切酶TaqI
abs60219
快速内切酶HpaI
abs60242
快速内切酶XbaI
abs60220
快速内切酶KpnI
abs60243
快速内切酶XhoI
abs60221
快速内切酶MluI
abs60244
内切酶SgeI
abs60222
快速内切酶MnlI
abs60084
T4DNALigase
四、酶切、回收后的PCR产物与载体质粒的连接
用T4DNALigase进行连接反应，不同厂家的连接酶按照说明书操作即可，如果担心质粒存在酶切不完全的情况在后续的转化中出现假阳性结果，可以将酶切后的产物不连接作为对照试验。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上，时间3个小时足已。
分类
货号
商品名
连接酶
abs60084
T4DNALigase
五、构建好的质粒做转化
将构建好的载体加入至感受态细胞中，冰中放置30分钟，42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟，
加入阴性培养基，37℃振荡培养60分钟，取其中一些铺板，过夜培养挑取单克隆进行摇菌，提取质粒即可。
分类
货号
产品
质粒纯化
abs60023
无内毒素高纯度质粒小量快速提取试剂盒
abs60024
无内毒素高纯度质粒大量快速提取试剂盒
六、其他克隆的试剂盒
分类
货号
商品名
常规克隆
abs60085
T-Vector快速克隆试剂盒
abs60089
pBM21快速克隆试剂盒
abs60090
pBM22快速克隆试剂盒
TOPO克隆
abs60091
T-VectorpTOPO快速克隆试剂盒
abs60094
BluntpTOPO快速克隆试剂盒
abs60095
pBM16AToposmart快速克隆试剂盒
abs60096
pBM27Toposmart快速克隆试剂盒
点突变
abs60097
定点突变试剂盒
abs60099
XL定点突变试剂盒
abs60100
多点定向突变试剂盒
abs60104
随机突变试剂盒
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